FluOpti es un dispositivo de hardware abierto diseñado para estudiar la respuesta de redes génicas bacterianas frente a estímulos de luz mediante control optogenético. El sistema integra la detección de señales de fluorescencia multicanal, el registro del crecimiento bacteriano por luz de campo claro y el control de la temperatura mediante un vidrio ITO. FluOpti permite programar y controlar de manera independiente luces LEDs azules para excitación de moleculas fluorescentes, luces blancas para medir crecimiento bacteriano en campo claro, y luces LEDs rojas y verdes para el control optogenético del sistema CcaS/CcaR (verde induce y rojo reprime el sistema genético). El dispositivo combina y extiende avances previos en microscopía automatizada, optogenética y hardware abierto para biología tales como:
- Fluopi: https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0187163
- Control (en medio liquido) del sistema CcaS/R en E. coli: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/24608181/
- Control de temperatura mediante vidrios ITO (Tim Rudge and Kevin Simpson, unpub. )
- El sistema de microscopia fluorescente esta compuesto de LEDs de 470nm + difusor + filtro azul de acrilico como ilimunación de excitación, y el uso de un filtro naranjo de acrilico que permite transmitancia de longitudes de onda verdes, amarillas y rojas (long pass >510nm).
- El reporte de estados celulares mediante proteina una fluorescente verde (sfGFP) y una roja (mBeRFP, long stokes shift con espectro de excitación en azul). Esto permite excitar dos proteinas al mismo tiempo, obteniendo dos señales distinguibles, sin la necesidad de utilizar "filer wheels" moviles.
- El sistema optogenetico se basa en el sistema CcaS/R de Jeff Tabor Ong 2018:, el cual se induce por luz verde y se apaga por luz roja. Un anillo de LEDS rojos y verdes son utilizados para el control optogenetico.
- El sistema de iluminacion para obtener imágenes de campo claro se basa en LEDs blancos rodenado la placa. Esto permita medir el crecimiento de las colonias bacterianas de manera apropiada, incluso en celulas no fluorescentes.
El proyecto también considera la necesidad de implementar sensores que permitan calibrar el sistema y monitorear variables determinadas, tales como intensidad o temperatura.
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Los LEDs azules empleados para iluminar la muestra corresponden a los Super Bright 5mm Blue:
- Longitud de onda: 470nm
- Forward current: 30mA @ 3.3V
- Peak forward current: 100mA
- Max voltage forward: 3.8V
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Los LEDs verdes empleados para la activación de genes corresponden a los Kingbright WP7083ZGD/G:
- Longitud de onda: 520nm
- Forward current (typ): 20mA @ 3.2V
- Peak forward current: 100mA
- Max voltage forward: 4V
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Los LEDs rojos empleados para la desactivación de genes corresponden a los Deep-Red 5mm LED:
- Longitud de onda: 660nm
- Forward current (typ): 20mA @ 2.2V
- Peak forward current: 100mA
- Max voltage forward: 2.8V
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Los LEDs blancos se implementan por medio de una tira LED comercial. Típicamente su operación se caracteriza por:
- Forward current: 20mA @ 12V
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El control implementado es via PWM, con el fin de regular la intensidad lumínica de los LEDs. Se opta por este control debido a su sencilla implementación.
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El sistema cuenta con un sistema de distribución de potencia para alimentar todos los sub-módulos, LEDs y raspberry PI.
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El sistema puede, además, contar con la posibilidad de leer sensores que permitan medir y calibrar la intensidad de luz proveniente desde los LEDs. Dado que el control se implementa por medio de una raspberry, es necesario utilizar sensores digitales o incluir en el diseño un ADC que permita realizar la conversión. En este último caso será necesaria la inclusión de una etapa que acondicione las señales provenientes desde los sensores. El sensor de intensidad lumínica tiene que cumplir:
- Bajo costo
- Fácil de conseguir
- Respuesta plana para los LED Rojo y Verde
Una alternativa es el fototransistor TEMT6000.
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El sensor de temperatura es un NTC (termistor). Aquí.
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El heater es del tipo resistivo y se debe poder alimentar con 9V ó 12V. Se debe implementar un control PWM de corriente utilizando un transistor. Una posible alternativa de heater es el Film Heating Panel.
El principal criterio de diseño considerado es la modularidad, con el objetivo de poder entregar una solución adaptable y escalable. Los parámetros prácticos de elección de componentes dependen de los requerimientos específicos del sistema. El esquema general consiste en un módulo que genera señales PWM, el cual es controlado por protocolo serial I2C. Este módulo genera 16 señales de PWM permitiendo controlar hasta 16 canales. Estas señales PWM controlan los módulos driver. Estos últimos ajustan la señal PWM a los requerimientos que necesitan los distintos tipos de circuitos de LEDs. Cada driver puede poseer uno o más canales dependiendo de la cantidad de subcircuitos independientes que se deseen controlar por tipo de LED. Del mismo modo, algunas de estas señales de control PWM pueden dejarse a disposición del usuario en caso que necesite controlar una placa con driver ya existente, como es el caso de este proyecto.
El otro bloque importante es el sistema de distribución de poder, el cual se encarga de generar todos los voltajes necesarios para los distintos bloques y etapas del circuito, dependiendo de cada requerimiento. La idea principal es que la placa reciba una única alimentación y que, internamente, genere los distintos voltajes y corrientes, contribuyendo, así, a la adaptabilidad de la solución.
Por último, la placa considera la inclusión de un ADC de 4 canales, controlado por I2C, el cual permite leer hasta 4 sensores analógicos. Es necesario contar con un ADC, ya que la Raspberry Pi no cuenta con ADC. Esto permite otorgar una alta adaptabilidad, ya que es posible conectar distintos tipos de sensores analógicos, dependiendo de la aplicación. Para esto, la placa considera etapas de acondicionamiento de señal, las cuales se deben configurar para el sensor específico.
Las principales características de la solución propuesta son:
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Adaptabilidad: La placa total solo se controla por medio de un bus I2C (3 pines), independiente de la cantidad de LEDs y sensores que se deseen utilizar.
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Integración: La disposición de canales de control PWM permite integrar tanto las soluciones existentes como soluciones creadas por distintos fabricantes.
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Escalabilidad: Gracias a la utilización del protocolo I2C, es posible controlar múltiples de estas placas con una sola Raspberry Pi (o un solo microcontrolador/procesador en general). Si se integran dos placas en serie se puede llegar a disponer de 32 canales de control de LEDs y 8 canales de sensores analógicos.
El ADC escogido es el ADC de la empresa Texas Instruments. La empresa adafruit posee un módulo autocontenido para integrar este ADC a la Raspberry Pi, así como una completa documentación y las bibliotecas para utilizarlo.
Las principales características de este ADC se enlistan a continuación
- 4 canales, single-ended.
- 16 bits de resolución
- Voltaje de alimentación entre 2V a 5V
- Interfaz I2C
- Referencia interna
Los sensores que se utilizarán permiten implementar el proceso de medición gracias a la variación de sus propiedades eléctricas. En general, estas variaciones se evidencian mediante un cambio de voltaje. En consecuencia, este es el voltaje que debe ser adquirido por el circuito electrónico. Por ello, en primera instancia, se dispone de un circuito divisor que, al ser conectado con el respectivo sensor, permite obtener el voltaje asociado a la medición. En la siguiente figura se muestra un ejemplo de esta conexión circuital, para el caso de un sensor de temperatura del tipo termistor (NTC):
Para realizar correctamente la adquisición de las señales desde los sensores es necesario contar con una etapa de acondicionamiento de señal. De esta forma, se asegura que los valores de voltaje que entreguen los sensores se encuentren dentro de los límites que permiten las entradas del ADC y de la Raspberry. No solo es deseable que se opere dentro de los límites, sino también aprovechar el rango de lectura al máximo, es decir, que el voltaje mínimo de medición sea igual (o lo más cercano posible) al voltaje mínimo que permiten los pines del ADC. Y, la misma relación con el voltaje máximo de medición.
Dado que aún no existe 100% de certeza sobre los sensores a utilizar, se implementó una circuito genérico de acondicionamiento, el cual se compone de una etapa de amplificación y otra de adición de offset. En la siguiente figura se muestra este circuito:
Los símbolos de switches corresponden, en la práctica, a un solder jumper, el cual conecta la entrada con la salida solo si se unen con soldadura sus terminales. Si se conectan S1, S2 y S3 el circuito queda configurado como un buffer, lo cual, de todas formas, beneficia a la señal adquirida puesto que el buffer disminuye su impedancia. Conectando o no S1, S2 y S3 se pueden obtener distintas configuraciones: solo amplificador, solo adición de offset, o ambas. Además, los valores de las resistencias se pueden ajustar dependiendo de los sensores que se utilicen, de tal forma de fijar correctamente la ganancia y el offset, según sea el caso.
La generación de PWM se realiza por medio de un circuito integrado PCA9685. La empresa adafruit posee un módulo autocontenido para integrar este módulo a la Raspberry Pi, así como una documentación completa y las bibliotecas para utilizarlo.
Principales características:
- 16 canales dimeables por PWM.
- 12 bits de resolución
- Voltaje de alimentación etre 2.3V a 5.5V
- Interfaz I2C
Para los canales de bajo consumo de corriente, tales como los arreglos de LEDs rojos y verdes, se utilizará el integrado ULN2803. Este integrado implementa un arreglo de 8 transistores tipo darlington, haciendo posible el control de hasta 8 canales en un único integrado.
Principales características:
- Arreglo de 8 canales
- Poseen alimentación común
- La corriente máxima por canal es de 500mA, pudiendo aumentar esta cantidad si se consideran canales en paralelo.
Para los canales de alto consumo se utilizará un transistor mosfet IRF740. Es necesario contar con un transistor por canal. Y, para casos de alta corriente (superiores a 1A) es necesario considerar la inclusión de disipadores (heatsink) o pads de disipación que permitan una evacuación efectiva del calor.
Principales características:
- Altas frecuencias de switching
- Bajo consumo de operación
- Control de hasta 10A (ó 40A en corrientes pulsantes)
- Simple implementación
Como se mencionará más adelante, la alimentación que llegará al circuito electrónico implementado será de 12VDC, por lo que es necesario contar con convertidores de voltaje DC-DC para generar los distintos voltajes de alimentación que se requieren en el circuito. En particular, es necesario generar 5V y 3.3V para alimentar los circuitos analógicos y digitales, y un set de voltajes para alimentar los distintos arreglos de LEDs y el Heater. Se decidió disponer de los siguientes voltajes para este último uso: 9V, 16V, 20V y 24V. A continuación se especifican los convertidores empleados para generar cada uno de los voltajes mencionados.
- Integrado: LM2596R-5.0
- Tipo: Step-down, regulador switching
- Frecuencia de switcheo: 150kHz
- Corriente máxima de salida: 3A
- Integrado: AP2112K-3.3
- Tipo: LDO, regulador lineal
- Corriente máxima de salida: 600mA
- Integrado: LM2696SX-ADJ
- Tipo: Step-down, regulador switching ajustable (voltaje de salida es configurable según indicaciones de conexión en el datasheet)
- Frecuencia de switcheo: 150kHz
- Corriente máxima de salida: 3A
- Integrado: XL6008E1
- Tipo: Step-up, regulador switching ajustable (voltaje de salida es configurable según indicaciones de conexión en el datasheet)
- Frecuencia de switcheo: 400kHz
- Corriente máxima de salida: 3A
Dado que el circuito electrónico funcionará con alimentación DC es necesario emplear una fuente DC que se enchufe directamente a la red y que entegue un voltaje de salida continuo. En particular, se decidió emplear una fuente DC conmutada. Sus principales características son:
- Voltaje de entrada: 100-120VAC / 60Hz, 200-240VAC / 50Hz
- Voltaje de salida: 12V
- Corriente máxima de salida: 10A
- Potencia máxima de salida: 120W
Este proyecto esta financiado por ANID Millennium Science Initiative Program (ICN17_022) y el Fondo de Desarrollo Científico y Tecnológico (FONDECYT FONDECYT Regular 1211218 & FONDECYT Regular 1241452 dirigido por Fernan Federici)